深低温冻存同种异体皮肤移植中转化生长因子β1的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.18.001

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (18): 3231-3238.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.18.001

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深低温冻存同种异体皮肤移植中转化生长因子β1的表达

曹立颖^{1, 2}，丁轩玺^{1, 2}，杨声坪^{1, 2}，王冠^{1, 2}，姜明静¹，张玉兰³，王建民^{1, 2}

1兰州大学第一临床医学院，甘肃省兰州市 730000
2兰州大学第一医院骨科，甘肃省兰州市 730000
3甘肃中医学院，甘肃省兰州市 730000

收稿日期:2013-02-06 修回日期:2013-03-08 出版日期:2013-04-30 发布日期:2013-04-30
通讯作者: 王建民，硕士生导师，主任医师，兰州大学第一医院骨科主任，兰州大学第一临床医学院，甘肃省兰州市 730000；兰州大学第一医院骨科，甘肃省兰州市 730000 lyw6743@sina.com
作者简介:曹立颖★，男，1985年生，福建省龙岩市人，汉族，兰州大学在读硕士，主要从事创伤骨科方面的研究。 272893052@163.com
基金资助:
甘肃省自然科学研究基金项目(1107RJZA 215)。

Expression of transforming growth factor beta 1 of cryopreserved skin allograft

Cao Li-ying^{1, 2}, Ding Xuan-xi^{1, 2}, Yang Sheng-ping^{1, 2}, Wang Guan^{1, 2}, Jiang Ming-jing¹, Zhang Yu-lan³, Wang Jian-min^{1, 2}

1 The First Clinical Medicine College of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
2 Department of Orthopedics, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
3 Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, Gansu Province, China

Received:2013-02-06 Revised:2013-03-08 Online:2013-04-30 Published:2013-04-30
Contact: Wang Jian-min, Master’s supervisor, Chief physician, the First Clinical Medicine College of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; Department of Orthopedics, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China lyw6743@sina.com
About author:Cao Li-ying★, Studying for master’s degree, the First Clinical Medicine College of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; Department of Orthopedics, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China 272893052@163.com
Supported by:
Natural Science Foundation of Gansu Province, No. 1107RJZA215

摘要/Abstract

摘要：

背景：皮肤移植和创面覆盖是创伤、烧伤治疗的重要措施。目前，同种异体皮仍然是可利用的最佳创面覆盖物。
目的：通过检测转化生长因子β1在深低温冻存后的大鼠同种异体皮肤移植后的表达，评估深低温贮存同种异体皮在创面上的应用。
方法：取大鼠皮肤保存于低温-20 ℃(低温保存组)及-80 ℃深低温(深低温保存组)，冻存1周、1，2个月后，皮片分组移植于同种大鼠背部进行实验，并以自体移植大鼠作为对照组。
结果与结论：同低温保存组相比，深低温保存组转化生长因子β1的表达被抑制，移植皮肤排斥反应出现时间延迟及存活时间延长，排斥反应评分也较低。同低温冻存相比，深低温冷冻保存能使同种异体移植物的转化生长因子β1抗原表达降低。提示深低温冻存的异体皮作为一种创面临时覆盖物，在存在皮肤组织缺失或皮源不足的情况下具有广阔的应用前景。

关键词: 器官移植, 组织移植, 同种异体皮肤, 深低温冻存, 转化生长因子β1, 排斥反应, 创面覆盖, 皮肤移植, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Skin transplantation and wound surface coverage are the most important measures for the treatment of wound and burn. At present, allogenic skin still is the best available wound coverage.
OBJECTIVE: To evaluate the application of allogeneic skin in the wound by detecting the expression of transforming growth factor-β1 in rat skin allograft under cryopreservation.
METHODS: The skin specimens of rats were preserved at -20 ℃ (low temperature preservation group) or at
-80℃ (cryopreservation group) for 1 week, 1 month and 2 months, respectively. Then skin pieces in each group were transplanted into the back of rats. Autologous skin grafting rats were as control group.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with low temperature preservation group, the expression of transforming growth factor-β1 in the cryopreservation group was inhibited, rejection of skin allograft was delayed and survival time was prolonged. Histology score of skin rejection was also lower in the cryopreservation group. Compared with low temperature preservation, cryopreservation could reduce expression of antigen of transforming growth factor-β1 in skin allograft. The results show that cryopreserved allograft skin as a kind of wound temporary coverage has wide application prospect in case that skin tissue is inadequate or insufficient.

Key words: organ transplantation, tissue transplantation, skin allograft, cryopreservation, transforming growth factor beta 1, rejection, wound coverage, skin transplantation, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

曹立颖，丁轩玺，杨声坪，王冠，姜明静，张玉兰，王建民. 深低温冻存同种异体皮肤移植中转化生长因子β1的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(18): 3231-3238.

Cao Li-ying, Ding Xuan-xi, Yang Sheng-ping, Wang Guan, Jiang Ming-jing. Expression of transforming growth factor beta 1 of cryopreserved skin allograft[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(18): 3231-3238.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 实验动物分组部分共纳入SD大鼠42只，均进入结果分析，无脱落。

2.2 低温保存和深低温保存对移植皮肤排斥反应出现及存活时间的影响 自体移植组6只SD大鼠皮肤移植后均活跃，尿便排泄正常，体质量无明显改变，伤口无明显红肿，再植皮肤血运良好，皮温正常，皮肤移植后早期出现肿胀，但能逐渐自行消退，再植皮肤可长期存活。同种异体皮肤移植36只大鼠体质量无明显减轻。皮肤移植后结果见表1和图1，和低温组相比，深低温保存组大鼠皮肤排斥反应出现时间延迟及存活时间延长(P < 0.01或P < 0.05)。

2.3 低温保存和深低温保存对移植皮肤排斥反应程度的影响 和低温保存保存后皮肤异体移组相比，深低温植后组织排斥反应程度较轻(P < 0.05)，见表2和图2。

2.4 低温保存和深低温保存对移植皮肤中转化生长因子β1表达水平的影响 免疫组织化学检测显示，各组移植皮肤细胞内均有少量的转化生长因子β1表达，主要分布在上皮基底细胞层、真皮浅层。

移植后3 d，创面浅层成纤维细胞，毛囊上皮细胞内有阳性细胞表达，主要分布在胞浆内。移植后7-10 d，转化生长因子β1表达增强，主要分布在创缘、创面浅层，同时，真皮深层的成纤维细胞及毛细血管内皮细胞也可见转化生长因β1表达。移植后20 d转化生长因子β1恢复至接近正常。且深低温保存组移植皮肤中内源性转化生长因子β1表达水平低于自体移植组及低温保存组(P < 0.05)，表明在创面愈合过程中，深低温保存组的内源性转化生长因子β1表达被抑制，见图3，4，表3。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年12月至2012年10月在兰州大学第一医院中心实验室、病理科及兰州大学基础医学院神经解剖研究所完成。

材料：

实验动物：SPF级健康雌性SD大鼠48只，鼠龄7周，体质量180-220 g，由甘肃中医学院提供，实验动物许可证号：SCXK(甘)2011-0001。动物饲养环境为SPF级，实验过程对动物的处置符合相关动物伦理学要求。

异体皮移植的主要试剂及仪器：

Main reagents and instruments:

方法：

预处理皮肤：于术前1 d将SD大鼠以100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL/kg)后，用80 g/L硫化钠臀背部脱毛。在无菌实验室切取皮片：常规消毒手术区、铺巾。麻醉妥当后在大鼠背部切取直径3.5 cm圆形全层皮肤6处，创面直接缝合，共6只大鼠36片皮肤。获得未经消毒带皮下脂肪的异体皮后，剥光毛皮，以肥皂水刷洗，大量自来水冲洗，然后在1∶1 000新洁尔灭液中浸泡15 min，用无菌生理水冲洗。用取皮机修去皮下脂肪及部分真皮层，并修剪大小合适的皮片。将皮片放入无菌容器内，在10%二甲基亚砜溶液中浸泡15 min左右，生理盐水冲洗后装入无菌塑料袋内，皮片平放，加标签后密封并标明日期及来源。在4 ℃冰箱中存放2 h后取出，分别保存于-20 ℃和-80 ℃低温冰箱中保存备用，各保存18片。分别于冻存1周，1，2个月将低温贮存的异体皮连同包装袋一起置于40 ℃的水浴复温，用生理盐水反复冲洗3次。

皮肤移植：以7周龄SD大鼠作为受皮鼠，随机取36只大鼠等分为低温保存组和深低温保存组，每组按冻存时间不同，均等分为冻存1周，1，2个月3个亚组。取大鼠全层直径3 cm圆形皮肤缺口，生理盐水冲洗，覆盖上冻存皮片，将其与周围皮肤缝合，乙醇擦拭，生理盐水冲洗。无菌敷料加压包扎固定。腹腔注射头孢唑啉钠100 mg/kg预防感染。于无菌实验室内单笼饲养，注意保持伤口干燥，给予消毒食物及饮水。于皮肤移植后7 d拆除加压缝合包，10 d拆线。以自体移植组(n=6)作为阴性对照，取全层直径3 cm圆形皮片，去除皮下组织，并回植创面，用4号缝线缝合皮肤切口，乙醇擦拭，生理盐水冲洗术区。腹腔注射头孢唑啉钠100 mg/kg预防感染，单笼饲养，常规饮食。

实验动物分组：

Grouping of the animals:

移植后反应及创面情况：定期观察移植的异体皮与创面贴合情况，表皮真皮成活情况。记录各组移植皮肤免疫排斥出现时间和异体皮存活时间。以出现皮肤红肿和皮下水肿作为出现排斥反应。当皮肤出现焦痂、坏死、脱落时计为异体皮肤存活时间^[9-10]。

苏木精-伊红染色观察大鼠移植皮肤组织学变化：分别于皮肤移植后3，7，10，20 d切取移植肢体皮肤标本，40 g/L中性多聚甲醛缓冲固定液固定标本，常规脱水包埋，切成5 μm切片，苏木精-伊红染色，光镜下组织病理学检查，依照Büttemeyer等^[9]和Lee等^[10]肢体移植组织排斥反应分级标准进行评分。

免疫组织化学检测大鼠移植皮肤中转化生长因子β1阳性细胞的表达水平：分别于皮肤移植后3，7，10，20 d取皮肤创缘及周围0.5 cm左右宽的条形组织，40 g/L中性多聚甲醛缓冲固定液固定标本24 h(4 ℃)，低熔点石蜡定向包埋，切成5 μm切片，使用SABC法进行免疫组化染色。单克隆抗体转化生长因子β1为一抗，DAB显色。每种免疫组化染色均设阳性和阴性对照，阳性对照用表达转化生长因子β1抗原阳性的皮肤组织，阴性对照用PBS代替一抗。苏木精复染，光镜下观察。使用创业软件股份有限公司(杭州)研制的彩色图像分析系统进行结果分析。每张切片随机取5个高倍视野(×400)。用ImagePro Plus 6.0软件(美国Media Cybernetics公司)半定量分析免疫组化图片：选取图片上需要测量选择区域的面积，测量该区域的累积吸光度。选择并测量有效统计区域的面积，计算选择区域内的吸光度平均值，即平均吸光度值=累积吸光度/面积。

主要观察指标：创面观察皮肤排斥反应出现及存活时间及移植皮肤肿转化生长因子β1的表达水平。

统计学分析：应用IBM SPSS 19.0统计软件进行分析，多组间移植前后均数比较比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，不同时间段两两比较采用SNK-q检验；计量资料组间比较采用两独立样本资料的t 检验或配对资料的t 检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

各种原因所致的大面积皮肤缺损，由于自体皮来源不足或全身情况不允许，必须应用创面覆盖物来暂时覆盖创面，以便使患者渡过危机。临床上覆盖创面所使用的生物材料除了异体和异种皮肤、生物膜以外，人工皮发展迅速，但其存在一些问题^[11-12]。实践证明，使用有生机的异体皮肤覆盖创面，仍是目前最有效、最方便、经济实惠的方法^[13-15]。有活力的异体皮覆盖创面有以下一些优点：①防止创面干燥，减少创面水分蒸发，减少热量丧失。②防止电解质、蛋白质和红细胞从创面丢失。③减少创面污染，减轻创面疼痛。④有利于关节部位早日活动，改善功能。⑤保护暴露的肌健、血管和神经。⑥促进肉芽组织成熟，促进创面愈合，具有一定的抗感染能力。⑦经冷冻保存后的皮肤抗原性显著降低，可以在异体存活较长的时间，为临床救治争取时间。

然而，如何保存同种异体皮的活力是仍存在的问题。深低温冻存是目前最常用的方法之一^[16]。有研究表明，深低温冻存可使皮肤活力保持在原有的80%左右^[17-18]。对转化生长因子β的生物学功能研究主要在炎症、组织修复和胚胎发育等方面，转化生长因子β对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用^[19]。转化生长因子β1，β2和β3功能相似，以转化生长因子β1含量最高[7]。其分布于多种细胞、组织中，除了在细胞的增殖分化、胚胎发生、形态形成等具有重要的生物学作用外，还有抑制多种免疫细胞的增殖、分化及效应^[20-21]。转化生长因子能抑制免疫活性细胞的增殖，在治疗伤口愈合，促进软骨和骨修复以及通过免疫抑制治疗自身免疫性疾病和移植排斥等方面有潜在的应用前景。实验通过经深低温冻存的大鼠皮肤组织移植后生物活性、免疫原性及移植皮肤转化生长因子β1表达的研究，为深低温冻存皮肤、器官提供实验基础。

转化生长因子β1是一种多功能的多肽生长因子，近年来发现它在伤口愈合过程中起着重要的作用^{[7, 19]}。转化生长因子β1能直接刺激成纤维细胞外基质蛋白(包括纤维连接蛋白)、胶原、氨基葡萄糖等合成，并对新合成的细胞基质的降解具有明显的抑制作用^[20-23]。转化生长因子β1的这种作用是特有的。但研究表明，烧伤后转基因小鼠在角质细胞转化生长因子β1基因表达含量提高，皮肤创伤修复延迟^[24-25]。相反，转化生长因子β1基因敲除小鼠表现为促进上皮细胞增殖而加速创伤愈合^{[7, 26]}。实验结果表明，在正常皮肤有少量的转化生长因子β1表达，在皮肤移植后3 d，即创面愈合的炎症末期及增生期修复早期，创面浅层成纤维细胞内有少量阳性信号表达，此时各组结果差异无显著性意义。皮肤移植后7 d，创面处于细胞增殖旺盛期，成纤维细胞、血管内皮细胞分泌转化生长因子β1明显增多，此时，转化生长因子β1的表达差异有显著性意义(P < 0.05)。而和低温组相比，深低温保存组的内源性转化生长因子β1的表达被抑制，使得深低温保存组异体皮移植后排斥反应出现时间较低温组延迟及存活时间延长，排斥反应评分也较低。皮肤移植后10 d，创面已开始上皮化，细胞增殖过程停止。皮肤移植后20 d，转化生长因子β1的表达已接近正常皮肤。由此可见，深低温冷冻保存能使同种异体移植物的内源性转化生长因子β1抗原表达降低。但是，由于实验仅仅在组织层面研究了深低温冻存组织的作用，今后还需要在细胞及分子层面上深入研究经过深低温冻存后，移植皮肤组织的免疫原性降低的发生机制，从而为临床上应用提供依据。

综上所述，经深低温冻存的同种异体皮作为一种创面临时覆盖物，在存在皮肤组织缺失或皮源不足的外科疾病治疗中具有广阔的应用前景。深低温冻存的异体皮可应用于以下方面：①各种创面如开放性创面、浅度烧伤创面和切除创面的暂时覆盖。②用于自体皮的覆盖移植。③用于自体皮源紧张的创伤、烧伤后期整形病人的重建手术，作为微粒自体皮成活的支架。④用于暂不适合自体皮肤移植的创面或慢性溃疡创面等的覆盖以改善创基情况。

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Expression of transforming growth factor beta 1 of cryopreserved skin allograft

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